近年來，生物制藥行業(yè)呈現(xiàn)出繁榮發(fā)展的趨勢，很多大分子生物制品已經(jīng)過監(jiān)管部門批準上市，另有不少創(chuàng)新型大分子正處于臨床后期或上市前申報階段，即將為患者帶來福音。例如，基于CHO細胞表達的單克隆抗體、基于大腸桿菌（E.coli）體系表達的重組蛋白或納米抗體、基于HEK293細胞或昆蟲細胞SF9表達的腺相關病毒（AAV）、基于酵母細胞表達的病毒樣顆粒（VLP）等。不同于傳統(tǒng)的小分子化學藥，生物大分子的表達體系更為復雜，雜質種類更多（如宿主蛋白（HCP）和宿主DNA殘留(HCD)等），雜質結構相對復雜，這給下游純化帶來了極大的挑戰(zhàn)。

         基于傳統(tǒng)微球技術的層析工藝是生物大分子純化的重要手段，其具有工藝性能穩(wěn)定、放大性良好等優(yōu)點。近年來，多模式層析填料受到越來越多的關注。多模式層析填料往往具備至少兩種相互作用機制，其中最常見的是將離子交換模式與疏水相互作用模式結合，可以在廣泛的pH和電導率范圍內(nèi)有效純化目標分子。

圖1. HCPureTM配基結構和作用方式

HCPureTM是英國Astrea Bioseparations公司2023年推出的多模式層析填料，填料基架為粒徑均一的高交聯(lián)瓊脂糖，基架上修飾有化學合成的小分子配基（圖1），主要以疏水相互作用的方式結合料液中的雜質，同時兼具氫鍵相互作用模式（與市售主流產(chǎn)品作用原理不同，形成互補），適用于多種表達體系，在廣泛的上樣條件下，能穩(wěn)健的去除料液中的HCP（宿主細胞蛋白）、HCD（宿主細胞DNA）、聚集體、分子片段等工藝或產(chǎn)品相關雜質。表1展示了HCPureTM在常見的表達體系中雜質去除能力。

表1. HCPureTM在多種表達體系中的應用效果

1. HCPureTM在大腸桿菌（E. coli ）表達體系中可以有效去除HCP

在該應用案例中，研究人員使用大腸桿菌（E. coli ）表達納米抗體Vκ，收獲液先經(jīng)過Protein L親和層析純化，洗脫液經(jīng)中和后調(diào)節(jié)成不同的pH（6.0-8.0）和電導率（6-18mS/cm），隨后以流穿模式上樣HCPureTM，收集流穿液和淋洗液，檢測Vκ和HCP的含量，以探究HCPureTM的最佳上樣條件。測試條件如下表所示：

圖2. E.coli表達體系中HCPureTM上樣pH和電導率的探究

由圖2的檢測結果可知，在較低的pH（6.0）和較低的電導率（6ms/cm）上樣條件下，HCP的去除效果最佳，同時目標分子Vκ的回收率最高。在最優(yōu)上樣條件下，料液中的HCP可以從30000ppm降至200ppm（2個log值的去除能力），Vκ回收率大于85%（表2）。

表2. HCPureTM在E. coli 表達體系中可以有效去除HCP

2. HCPureTM在CHO細胞表達體系中可以有效去除HCP

在該應用案例中，研究人員使用CHO細胞表達IgG型單克隆抗體，澄清后的收獲液先經(jīng)過Protein A親和層析純化，洗脫液經(jīng)中和后調(diào)節(jié)成不同的pH（4.0-9.0）和電導率（8-18ms/cm），再以流穿模式上樣到HCPureTM中，收集流穿液和淋洗液，檢測IgG和HCP含量，其中，pH 6.0、電導率12ms/cm是未經(jīng)調(diào)節(jié)的親和層析洗脫中和液。

表3. CHO細胞體系中，不同上樣pH和電導率條件下，HCPureTM均可有效去除HCP

由表3的檢測結果可知，在廣泛的上樣pH和電導率范圍內(nèi)，HCPureTM均可有效的去除上樣料液中的HCP（平均84%），同時保持目標分子的高回收率（平均87%）。此外，由于pH 6.0、電導率12mS/cm是初始的親和層析洗脫中和液，因此，親和層析后，料液可不經(jīng)過調(diào)整或緩沖液置換，直接上樣到HCPureTM中，同樣保持優(yōu)秀的回收率和HCP去除效果，且大大節(jié)約了工藝時間和成本。

3. HCPureTM在CHO細胞表達體系中可以有效去除聚集體

在該應用案例中，研究人員使用CHO細胞表達IgG型單克隆抗體，料液經(jīng)過Protein A親和層析和陽離子交換層析純化后，在較低的pH和較高的電導率條件下孵育，誘導產(chǎn)生高含量的聚集體，再以流穿模式上樣HCPureTM，收集流穿液和淋洗液，檢測聚集體含量。

表4. HCPureTM可顯著去除抗體料液中的聚集體

由檢測結果（表4）可看出，料液經(jīng)過HCPureTM純化后，聚集體由初始的6.7%降低到2.9%，HCPureTM可顯著去除料液中的聚集體。

4. HCPureTM在HEK 293細胞表達體系中可以有效去除HCP

在該應用案例中，研究人員使用HEK293細胞以瞬轉的方式表達2型腺相關病毒（AAV-2），病毒載體經(jīng)過親和層析純化后，仍含有較高含量的低分子蛋白雜質，將親和層析洗脫液置換到PBS+200mM NaCl（pH 7.5）中，以流穿模式上樣到HCPureTM（10mm內(nèi)徑層析柱，柱高10cm），總上樣量為5.0E+13VP，收集流穿液和淋洗液進行分析。

圖3. SDS-PAGE檢測結果

表5. ELISA檢測結果

由SDS-PAGE結果（圖3）可看出，流穿液中包含大部分病毒衣殼蛋白VP1，VP2和VP3條帶（8-13泳道），而再生液（14泳道）中則包含大量的低分子蛋白雜質條帶，表明HCPureTM可以有效去除料液中的蛋白雜質分子。由ELISA檢測結果（表5）可知，流穿液中的病毒衣殼蛋白幾乎全部回收（接近100%），表明HCPureTM在去除蛋白雜質的同時可以保持優(yōu)秀的AAV回收率。

HCPureTM多模式層析填料技術參數(shù)

HCPureTM多模式層析填料產(chǎn)品信息

散裝填料

預裝柱

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Astrea Bioseparations于1987年孵化自劍橋大學，擁有超過30年層析介質研發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗，是世界級層析介質產(chǎn)品與服務供應商。目前使用Astrea的產(chǎn)品已有超過21個生產(chǎn)工藝通過了FDA和EMA的批準。Astrea Bioseparations在全球擁有3個研發(fā)和生產(chǎn)基地，專注為生物大分子和CGT領域提供行業(yè)領先的層析介質和技術服務。Astrea Bioseparations推出的基于納米纖維的新型層析技術，解決了傳統(tǒng)生物分離工具載量低和工藝耗時問題，實現(xiàn)更快、更環(huán)保、更具成本效益的純化過程，完全符合當今生物治療創(chuàng)新的需求。

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參考文獻：

1. J. Kreusser et al., Influence of pH value and salts on the adsorption of lysozyme in mixed-mode chromatography, 2021
2. R. Hess et al., Standardized method for mechanistic modeling of multimodal anion exchange chromatography in flow through operation, 2023
3. Technical Note: HCPURE?: A FIT FOR PURPOSE HOST CELL PROTEIN CLEARANCE SOLUTION IN E. COLI WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
4. Technical Note: HCPure? host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
5. Technical Note: HCPure? host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
6. Technical Note: HCPURE?: HOST CELL IMPURITY REMOVAL IN CHO WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
7. Technical User Guide: HCPureTM, Astrea Bioseparations